基本參數(shù)

品牌：Abbexa

產(chǎn)品編號：abx542962

規(guī)格：96孔

檢測范圍：0.156納克/毫升 ●10納克/毫升

靈敏度：＜0.06納克/毫升

儲存條件：洗滌緩沖液、TMB底物液和終止液于4℃儲存，試劑盒其余組分于-20℃儲存。

應(yīng)用范圍：用于定量檢測人組織勻漿、細(xì)胞裂解液及其他生物體液中的RNF128。

檢測原理：

●本試劑盒基于夾心酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)。

●96孔板已預(yù)先包被抗體，向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品及生物素偶聯(lián)試劑并孵育，隨后加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)試劑并再次孵育。

●每一步孵育后，使用洗滌緩沖液去除未結(jié)合的偶聯(lián)物。

●通過TMB底物液對HRP的酶促反應(yīng)進(jìn)行定量：加入TMB底物液后，僅含足量RNF128的孔會生成藍(lán)色產(chǎn)物，加入酸性終止液后，藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

●黃色深淺與板上結(jié)合的RNF128含量成正比。

●使用酶標(biāo)儀在450納米波長下測定吸光度（OD值），據(jù)此計算RNF128的濃度。

試劑盒組分

1.已提供的材料

●預(yù)包被96孔微孔板：12×8孔

●標(biāo)準(zhǔn)品：2管

●洗滌緩沖液（25倍濃縮液）：30毫升

●樣品/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液：20毫升

●檢測試劑A（100倍濃縮液）：120微升

●檢測試劑B（100倍濃縮液）：120微升

●稀釋液A：10毫升

●稀釋液B：10毫升

●TMB底物液：10毫升

●終止液：10毫升

●封板膜：4張

●密封袋：1個

2.所需但未提供的材料

●37℃恒溫培養(yǎng)箱

●多通道和單通道移液器及無菌移液器吸頭

●洗瓶或自動酶標(biāo)洗板機(jī)

●1.5毫升離心管

●蒸餾水

●吸水濾紙

●100毫升和1升容量瓶

●冰

●酶標(biāo)儀（波長：450納米）

●ELISA搖床

實驗步驟

A. 樣品制備

樣品需立即檢測或于2-8℃儲存（24小時內(nèi)）；長期儲存需分裝后置于-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。樣品制備過程中需置于冰上，檢測前恢復(fù)至室溫。

1. 組織勻漿：不同組織的勻漿制備方法有所差異，以下為示例流程。用冰浴PBS沖洗組織以去除殘留血液，稱重后切碎，在冰浴條件下用組織勻漿機(jī)于PBS中勻漿，隨后超聲處理細(xì)胞懸液；10000×g離心5分鐘，收集上清液。

2. 細(xì)胞裂解液：用胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集后棄去上清液；用冰浴PBS洗滌細(xì)胞3次，重懸于PBS中；超聲裂解細(xì)胞4次，或于-20℃冷凍后室溫解凍3次；2-8℃條件下1500×g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片，收集上清液。

3. 其他生物體液：約1000×g離心20分鐘去除沉淀物，樣品需立即檢測或分裝后置于-20℃或-80℃儲存。

※注意事項

●樣品需稀釋至預(yù)期濃度處于試劑盒檢測范圍內(nèi)。

●建議使用新鮮樣品或近期獲取的樣品，以防蛋白質(zhì)降解和變性導(dǎo)致結(jié)果偏差。

●不可使用NaN?作為樣品防腐劑，因其會抑制HRP的活性。

●若可能，固體樣品應(yīng)采用超聲和/或勻漿法制備，裂解緩沖液可能（偶爾）影響試劑盒性能。

●若手冊應(yīng)用范圍中未提及某類樣品，需通過預(yù)實驗驗證試劑盒對該樣品的適用性。

B. 試劑制備

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：向標(biāo)準(zhǔn)品中加入1毫升標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液，配制為10納克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)品母液（濃度標(biāo)準(zhǔn)品）。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品室溫靜置10分鐘，期間輕輕振蕩，避免產(chǎn)生泡沫或氣泡。準(zhǔn)備離心管并標(biāo)記，用于梯度稀釋——除濃度標(biāo)準(zhǔn)品管外，其余各管加入0.5毫升標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液；取0.5毫升濃度標(biāo)準(zhǔn)品母液加入第1管，充分混勻后，從第1管轉(zhuǎn)移0.5毫升至第2管，依次梯度稀釋。

   ●注意：復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品時切勿渦旋振蕩，以免導(dǎo)致蛋白質(zhì)失穩(wěn)；復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品需在15分鐘內(nèi)使用，不建議重復(fù)使用。

   ●梯度稀釋濃度序列（單位：納克/毫升）：10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16

2. 洗滌緩沖液：用蒸餾水將濃縮洗滌緩沖液按1:25比例稀釋（即30毫升濃縮洗滌緩沖液加入720毫升蒸餾水）。若濃縮洗滌緩沖液出現(xiàn)結(jié)晶，可室溫溫育并輕輕振蕩至結(jié)晶溶解。

3. 檢測試劑A工作液：實驗前15分鐘內(nèi)制備

   ●計算所需工作液總體積；

   ●用稀釋液A將檢測試劑A按1:100比例稀釋，充分混勻，移液時動作緩慢平穩(wěn)，減少體積誤差。

4. 檢測試劑B工作液：實驗前15分鐘內(nèi)制備

   ●計算所需工作液總體積；

   ●用稀釋液B將檢測試劑B按1:100比例稀釋，充分混勻，移液時動作緩慢平穩(wěn)，減少體積誤差。

C. 檢測步驟

按上述要求制備所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑，使用前將試劑盒組分和樣品恢復(fù)至室溫。建議所有檢測做雙復(fù)孔，并為每次檢測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 在預(yù)包被板上分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔和對照（空白）孔，記錄各孔位置；向各孔底部加入對應(yīng)溶液，避免接觸孔壁；加樣前將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品上下顛倒混勻，避免產(chǎn)生泡沫或氣泡。

2. 向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100微升稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品。

3. 向?qū)φ眨瞻祝┛字屑尤?00微升標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液。

4. 向樣品孔中加入100微升適當(dāng)稀釋的樣品，輕輕拍打平板或使用酶標(biāo)搖床混勻。

5. 用封板膜覆蓋平板，37℃孵育2小時。

6. 揭開封板膜，棄去孔內(nèi)液體，暫不洗滌。

7. 向各孔加入100微升檢測試劑A工作液，用封板膜覆蓋平板，37℃孵育1小時。

8. 揭開封板膜，棄去孔內(nèi)溶液，用1×洗滌緩沖液洗滌平板3次：用多通道移液器或自動洗板機(jī)向各孔加滿洗滌緩沖液（350微升），建議浸泡1-2分鐘；每步需棄去孔內(nèi)液體，末次洗滌后，通過抽吸或傾倒去除殘留洗滌緩沖液，將平板倒置在干凈的吸水濾紙上拍干。

9. 向各孔加入100微升檢測試劑B工作液，密封平板，37℃孵育1小時。

10. 揭開封板膜，棄去孔內(nèi)溶液，按步驟8方法重復(fù)洗滌5次。

11. 向各孔加入90微升TMB底物液，用封板膜覆蓋平板，輕輕拍打混勻，37℃孵育10-20分鐘（孵育時間僅供參考，時間需用戶自行確定），避免光照。

12. 向各孔加入50微升終止液，需快速且均勻地混勻整個平板內(nèi)的終止液，確保酶滅活。

13. 確保平板底部無指紋和水漬，孔內(nèi)液體無氣泡，立即在450納米波長下測定吸光度（OD值）。

計算方法

計算各標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔的OD450平均值，減去對照（空白）孔的OD平均值：

相對OD值=各孔OD值-空白孔OD值

以各標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對OD值為X軸，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品的相對OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上插值得到樣品濃度。若樣品已稀釋，需將插值得到的濃度乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的原始濃度。

※注意事項

1. 使用試劑盒前，離心各試管，使附著在管蓋上的組分沉降至管底。

2. 孵育間隔期間，切勿長時間敞露孔板；每步加樣時間不應(yīng)超過10分鐘。

3. 孵育過程中需確保平板密封良好，嚴(yán)格控制孵育時間和溫度。

4. 移液器吸頭和試管不可重復(fù)使用。

5. 不可使用過期組分或不同試劑盒的組分。

6. TMB底物液需在無菌條件下使用，盡量減少光照；未使用的底物液應(yīng)為無色或極淺的黃色，切勿將剩余溶液倒回原瓶。

7. 本試劑盒經(jīng)優(yōu)化用于檢測天然樣品，而非重組蛋白或合成化合物；由于重組蛋白的序列或三級結(jié)構(gòu)可能與天然蛋白不同，無法保證對重組蛋白的檢測效果。

精密度

1. 批內(nèi)精密度（同一次實驗的精密度）：對3份低、中、高濃度的RNF128樣品，在同一塊平板上各檢測20次。

2. 批間精密度（不同實驗間的精密度）：對3份低、中、高濃度的RNF128樣品，在3塊不同平板上檢測，每塊平板做8個復(fù)孔。

變異系數(shù)（CV）計算公式：CV（%）=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100

●批內(nèi)變異系數(shù)：＜6%

●批間變異系數(shù)：＜10%

典型數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線

提供的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅用于演示，每次實驗均需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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