• 共價結合，可實現穩(wěn)健，可靠，可重復的側向流動分析

nanoComposix是精密工程和高度特征化納米粒子制造商。我們的使命是幫助我們的客戶將納米技術產品推向市場。我們的多學科技術團隊提供快速原型設計，表征，集成和擴展解決方案，以加速各種應用領域的研發(fā)和商業(yè)化，包括生物診斷，局部治療，納米醫(yī)學，抗菌涂層和色彩工程。

自2004年以來，nanoComposix已為數千名客戶提供單分散和非團聚金屬和金屬氧化物納米材料。數百種不同的材料，尺寸，形狀和表面可供選擇，我們已經生產了2000多種定制的核/殼，生物功能化，熒光和磁性納米復合材料，以滿足客戶的要求。NanoComposix生產了NIST納米銀參考材料，我們的顆粒已被用于400多篇同行評審的出版物中。我們所有的材料都提供分析證書，包括電子顯微鏡，流體動力學直徑和每批次的光學數據，以保證產品符合規(guī)格。合同制造的規(guī)模從小燒杯到數千升不等。用于醫(yī)療設備和臨床試驗的納米材料在我們的ISO13485和cGMP兼容潔凈室設施中生產。通過利用我們*的納米材料庫，我們的目標是幫助客戶快速將納米技術產品從概念轉化為商業(yè)化。

側流檢測是一種快速、獨立的診斷試驗，可以檢測出各種分析物.該測試價格低廉，攜帶方便，可在常溫下儲存，并有很長的貨架壽命。 e.該分析提供診斷結果，不需要樣品處理或額外設備，使這種格式為理想的護理點和現場診斷。每一個側面的關鍵部件 W檢驗是用分子識別元件(通常是抗體)涂層的檢測器粒子。在橫向流動檢測中常用的一種檢測粒子是金納米粒子wh。 Ich有非常大的吸收截面，使它們在綁定到測試行時易于可視化(參見圖1)。制備金共軛探測器粒子的分子識別方法 ENT必須與金顆粒的表面結合。一個創(chuàng)建這些抗體綴合物的方法是簡單的混合顆粒的金納米粒子和抗體結合在一起，使抗體 通過物理吸附與金納米顆粒表面結合。雖然這通常是成功的，但每一種生理吸附結合都必須根據鹽濃度、pH和抗體/部分進行優(yōu)化。 柱比在某些情況下，抗體與粒子表面的結合較弱，抗體可與表面解離，有可能破壞粒子的穩(wěn)定或降低pa。 質膜對分析物的結合親和力。另一種將抗體與粒子表面結合的方法是使用共價化學。共價結合提供了許多優(yōu)點 clouding暗晦，濕潤，

在更大范圍的樣本矩陣中增加共軛穩(wěn)定性

對粒子/抗體比率的更大控制

減少尋找適合抗體對所需的共軛反應次數

本白pi書提供了關于如何通過共價結合形成健壯和可靠的抗體結合的附加信息。

共價結合粒子

納米復合物為共價結合提供了三種不同的生物制備納米粒子：40 nm直徑的金納米球，80 nm直徑的金納米球和150 nm直徑的金納米。粒子Ar E功能化的脂聚乙二醇酸(用于納米球)或硫辛酸(用于納米)，以產生一個*的羧基表面，共價結合在選定的靶向劑上的游離胺。共價 酰胺鍵之間的羧基和自由胺是通過EDC/Sulfo-NHS中間實現的(圖2)。對于抗體來說，賴氨酸殘基是EDC/NHS結合的主要靶位點。一個 典型IgG抗體有80~100個賴氨酸殘基，其中30~40個可與EDC/NHS結合。蛋白質，如牛血清白蛋白，有相似數量的可接近賴氨酸基團。 .

在共軛之前，抗體溶液在儲存緩沖液中不含有額外的游離胺是至關重要的，因為游離胺將與納米粒子上的結合位點競爭。f Ree胺，包括在Tris緩沖液或防腐劑sodium azide;  中發(fā)現的，必須除去，抗體必須轉移到合適的氨基緩沖液中。一種常見的執(zhí)行此操作的方法 洗滌步驟是使用自旋列(圖3)。此外，抗體溶液中的任何附加穩(wěn)定蛋白也必須去除。蛋白質A或其他親和柱可用于 其他蛋白質的抗體。蛋白質純化應該首先進行，因為從親和柱中洗脫抗體通常需要使用含有胺的緩沖液。潛艇 然后需要將抗體依次純化成無胺緩沖液.抗體純化的步驟詳見下文。

材料( material的名詞復數 )

微孔超0.5mL 10K蛋白質純化和濃縮過濾器(目錄#UFC 5096)

2毫升微離心管可容納過濾器

微型離心機

需純化的抗體(例如，每個過濾器的抗體為0.1至2毫克)

·純化緩沖液(例如10毫米磷酸鉀或其他無胺緩沖液)

蛋白質定量用bca檢測試劑盒和平板閱讀器或紫外-可見分光度計

凈化協議

在微離心管內放置過濾器。

加入450升純化緩沖液，在13.8K RCF離心5分鐘，預沖洗濾池。

將濾液處理到管子底部。

ALI抗體溶液進入過濾器并關閉蓋子。該過濾器可容納500微升，如果凈化體積超過這一能力，離心機濃縮和添加更多的未純化抗體之前。 繼續(xù)清洗步驟。如果初始抗體量小，則加入緩沖液，可達~450μL的總體積。

用13.8K RCF離心5分鐘濃縮。

從微離心管中取出含有濃縮抗體的過濾器。從微離心管底部取出濾液。

注：濾液可從清潔容器內的所有洗滌步驟中保留下來。如果由于穿透濾池而產率特別低，則可從保留的濾液中回收抗體。

將含有濃縮抗體的過濾器放回試管中，并在濾池中加入350毫升的純化緩沖液。

在13.8K RCF離心5分鐘，洗滌/濃縮。

重復洗滌程序(步驟5-7)，再用350毫升的額外凈化緩沖液洗滌四次，共洗滌五次。

后一次清洗后，將設備倒轉到一個新的，清洗2毫升微離心管，并切斷蓋子。在1k RCF離心5 min，收集純化和濃縮抗體。奧普提 Mal恢復，立即進行反向旋轉。

將抗體溶液后濃度為≥1mg/mL保存。純化后，典型的推薦儲存方法是將純化的抗體≥1 mg/mL保存在螞蟻的基礎上。 供應商的分析證明。一般來說，應避免凍結/解凍循環(huán)。關于建議的儲存和處理程序，請參考抗體供應商的說明。

確定終蛋白質濃度

現在你已經純化了你的抗體，確定終的蛋白質濃度是很重要的。這可以通過一種基于SPECT中280 nm處溶液吸光度的方法來實現。 分光度法(A 280法)或二異氰酸酯(BCA)法。

1. 大樣本回收率

2. 精礦中樣品回收率低可能是由于吸附損失、濃度過高或樣品通過膜造成的。若要大限度地提高樣品回收率，請確保吸管針尖不起作用。 他沒有刺破濾膜。吸附損失取決于溶質濃度、疏水性、溫度、與過濾裝置表面的接觸時間、樣品組成和pH值。到 盡量減少損失，離心后立即取出濃縮樣品。如果起始樣品濃度較高，請監(jiān)測離心過程，以避免過濃。 樣本。過量的濃度會導致沉淀和潛在的樣品損失.如果樣品似乎通過膜，選擇一個較低的名義相對分子質量限制(NMWL)amico。 n超-0.5濾波器單元。收集濃縮/純化抗體后，可用少量純化緩沖液沖洗濾池內幾次，回收任何抗體t。 帽子可能在濾膜上。

3. 結合協議：步驟2：抗體結合

4. 抗體可以通過碳二亞胺交聯化學(EDC)與納米顆粒表面的端羧基結合。EDC與羧酸基團反應 形成活性酯中間體?；腔疦HS的加入提高了中間體的溶解度和穩(wěn)定性，該中間體與抗體的胺基團發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵Be。 抗體和納米粒子之間。下面的方法描述了羧基功能化納米粒子的抗體結合步驟。

5. 所需材料

6. 40 nm直徑生物制備羧基金納米粒子

7. 不加任何游離胺的純化抗體

8. 反應緩沖液(5毫米磷酸鉀，0.5%20 KmW PEG，pH 7.4)

9. European Defence Community歐洲防務集團

10. 羥基硫代琥珀酰亞胺

11. 猝滅劑（50%（W/V）羥胺）

12. 共軛稀釋劑(0.1x PBS，0.5%BSA)

13. 離心機

14. 標準微離心管(沒有特殊處理或殘留增塑劑)

15. [航]渦流

16. 旋轉者，轉動體

17. 共軛協議

18. 提出了40 nm直徑羧基金納米粒子在OD 20處1mL的共軛策略，在OD 20處產生1mL的抗體-金共軛物。適用于較大或較小的體積 MES，比例按比例或遵循特定的共軛協議提供的每個生物反應的羧基變體。

19. 重要事項：步驟1-6應在溶解EDC/Sulfo-NHS后立即完成，以盡量減少Sulfo-NHS酯在水中的水解，并提高共軛效果。

20. 在接枝前用10 mg/mL的H2O制備EDC和Sulfo-NHS。

21. 小貼士：確保EDC和磺胺類NHS試劑在打開小瓶前保持室溫。在每個微離心管中分別稱重1-10毫克EDC和磺基NHS。就在前面 在適當體積的H2O中溶解，使其濃度達到10 mg/mL。

22. 例子：EDC質量=2.38mg，添加238 LH2O質量為Sulfo-NHS=6.14毫克，添加614升H2O

23. 在40 nm羧基金納米粒子的1mL中加入200μg的EDC(20 L新鮮制備的EDC，在H2O中10 mg/mL)和400 g的Sulfo-NHS(40 L的新制備的Sulfo-NHS，在H2O中濃度為10 mg/mL)。

24. 漩渦溶液在室溫下旋轉30分鐘

25. 在3600 RCF離心10分鐘。

26. 小心移除上清液，去除任何過量的EDC/Sulfo-NHS，并在1mL反應緩沖液中重新懸浮。旋渦和(或)聲波使粒子*重新懸浮。

27. 加入抗體和漩渦溶液。

28. 旋轉時，在室溫下孵育2小時。請注意，較短或較長的孵育時間可能會提高結合的效果。

29. 孵化后，添加10升昆徹，以使任何剩余的NHS-酯類物質失活.旋轉時，在室溫下旋轉10分鐘。

30. 在3600 RCF離心10分鐘。小心去除上清液，并在1mL反應緩沖液中重新懸浮.旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

31. 重復離心和再懸浮以去除多余的抗體。

32. 再在3600 RCF離心10分鐘，取出上清液，用共軛稀釋劑使體積達到1mL。旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

33. 在4°C保存共軛物，不要凍結。

優(yōu)化共軛的附加提示

需要注意的是，宜的結合步驟是依賴于抗體的，并且抗體之間的優(yōu)化技術會有所不同。共軛物在溶液中應該是穩(wěn)定的，并且 與抗原有效而特異的結合。以下提示可以提高共軛的效率：

在pH值為5的條件下，EDC和Sulfo-NHS對羧酸基團的活化效果適。

當pH值為7~7.5時，伯胺對抗體與活性羧基發(fā)生反應的pH值高。在較高的pH值下進行反應，大大降低了.的半衰期。 NHS-酯中間體。

結合過程中抗體的濃度和抗體與納米粒子的孵育時間可進行調節(jié)，以確定宜條件。

共軛稀釋劑組分可以調整，以確定宜緩沖摩爾度，pH，阻滯劑，聚合物和表面活性劑。

共軛協議：步驟3：描述共軛

對共軛物的表征對于確?？贵w結合在粒子表面和共軛物是穩(wěn)定的是至關重要的。紫外可見光譜儀是一種可以利用的工具。 ED通過觀察等離子體共振吸收來評價其穩(wěn)定性。納米粒子在共軛前后的共振峰位置有輕微的變化，表明抗體具有 成功地與表面結合。如果共軛物聚集，峰移并變得更寬（圖4）。動態(tài)光散射是另一種可用于篩選SMA的工具。 通過測定流體力學尺寸和多分散性指數，得到聚集量。橫向流動試驗條也是評價共軛性能的一種有效方法，同時也是一種輔助手段。 申請這樣的結合。側流測試條可以含有與納米顆粒結合的抗體的特異性試劑，并提供了一種快速、簡便的檢測方法。 研究抗體是否成功結合并保持功能。

批量大小和每條帶鋼的價格

生物制備羧基粒子是在納米復合材料的ISO 13485符合質量體系，確保高批號-批次一致性的粒子性質。地段大小可達400，000 OD-MLS( 相當于1 OD金400 L)，單批可產生約1，000，000條。在供應合同中，客戶可以保留特定的批次，以便在一年內從同一批中取樣。 ，在切換到新批次時，由于重新優(yōu)化而減少任何停機時間。大量生產也使我們能夠以競爭力的價格提供具有廣泛特色的產品。什么時候 比較供應商定價，重要的是要調整為不同數量和不同濃度供應的價格。為了規(guī)范定價，我們通常用OD-mL來討論成本。 簡單的價格除以產品的OD溶液和體積。例如，如果在10 OD濃度下，100 mL體積的金納米粒子的成本為600美元，那么每OD-mL的成本為600美元。 /(100*10)=0.60美元。與其他許多供應商不同，我們的共價耦合解決方案具有*的成本效益，終成本僅略高于物理吸附產品的成本。 離子。當您考慮到開發(fā)時間更快、在各種樣品介質中更穩(wěn)定、每個粒子的抗體使用量更低、以及更好地控制抗體/粒子的優(yōu)點時， e比率，在許多情況下，使用共價結合可以降低凈成本和提高性能。

請隨時與我們的銷售人員聯系，提供報價或獲得更多的共價綁定幫助。

結論

我們的生物準備羧基金是一種簡單和成本效益的方法，以創(chuàng)造敏感，穩(wěn)健和可靠的金共軛物。我們有許多客戶無法做出穩(wěn)定的共軛w。 被動吸附，但與共價結合成功。在競爭性橫向流動測試中，顆粒表面的抗體數量對于調節(jié)動力至關重要。 C值范圍內，共價結合增加了對顆粒/抗體比值的控制。由于共價結合比被動吸附更有效，抗體量的減少 當使用昂貴的抗體時，需要建立一個測試可以導致化驗成本的凈減少。在我們手中，共價結合的優(yōu)點是快速清除抗體PAI的能力。 由于不再需要掃描每個納米粒子共軛物的鹽和pH，因此標準的EDC/NHS結合條件通常是次起作用。如果你還沒試過Coval 目前還沒有綁定，請與我們聯系，以幫助粒子選擇和綁定化學協議和支持。

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